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细胞质染色试剂Calcein-AM是绿色荧光标记的细胞质探针，是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，Calcein-AM由于在Calcein的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein留在细胞内，发出强绿色荧光。与其它同类试剂（如BCECF-AM和Carboxy-fluorescein diacetate）相比，Calcein-AM是最适合作为荧光探针去染活细胞的，因为它的细胞毒性很低，而且不会抑制任何的细胞功能，如增殖和淋巴球的趋化性。Calcein的激发和发射波长分别为Calcein -AM仅对活细胞染色。Calcein,AM和PI经常被结合用来作为活细胞和死细胞的双重染色。

• 染色液Calcein AM注意防潮，避免反复冻融。
  
• 染色液为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。
  
• 注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。
  
• 有效期为试剂盒未拆封前按要求条件保存的有效期，试剂拆封后请尽快使用完。

• 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 染色液为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
  
• 使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。
  
• 细胞处理需要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞。
  
• 标记的条件因细胞种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细胞类型、细胞的膜通透性等进行优化，确定最佳条件。
  
• 染色后立即进行分析。
  
• 本染色液可用于细胞涂片、细胞的检测。
  
• 由于Calcein-AM的工作液稳定性比较差，染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。
  
• Calcein-AM对湿度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量，分装密封保存。不可使用含水的吸头。
  
• 试剂A母液请拧紧螺旋盖，避免受潮失效。
  
• 以下使用方法仅供参考，根据需要使用，或者参考文献的使用方法。

• 用0.1%皂素或者0.1～0.5%地高辛孵育细胞10min，或者用70%乙醇孵育细胞30min，从而制备死细胞；
  
• 用15000倍～1500倍稀释（试剂盒中的母液）的PI溶液进行死细胞染色，以得到仅仅对细胞核染色，而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。
  
• 用1000倍～100倍稀释（试剂盒中的母液）的Calcein-AM进行死细胞染色，以得到不会对细胞质染色的最佳工作浓度。然后用此浓度进行活细胞染色，去观察是否活细胞能被染色。

• 染色工作液的配制：
  根据样品数按下列比例配制染色工作液。
  用HBSS缓冲液或无血清培养基将染色液1000倍稀释，充分混匀，即成染色工作液A。
  
  • 由于不同细胞系的最佳染色条件不同，初次实验建议做梯度实验，以确定Calcein-AM的最适浓度。梯度筛选的原则为使用最低的探针浓度得到最好的荧光结果。Calcein-AM染色时间一般15～30分钟。
    
  • 一般细胞Calcein-AM染色终浓度为试剂盒中母液的1000倍稀释即可，个别细胞可能需要提高浓度至500倍稀释或者延长染色时间。
    
  • 不可以用含血清培养基配制。
    
  • Calcein-AM染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。
• 收集样本细胞。
  
  • 根据下游检测仪器和应用需要，贴壁细胞时，可以先用胰酶-EDTA等消化细胞，制备成细胞悬液。
    
  • 也可以直接原位染色检测。
• 用PBS洗涤细胞两次。
  
  • 由于培养基中的血清等含有酯酶，导致Calcein-AM遇水会分解，会导致空白上升，所以需要用PBS洗涤数次直到完全洗净。
    
  • 贴壁细胞可以原位染色，注意吸除培养基前用培养板离心机离心，防止丢掉漂浮的死细胞。PBS洗涤时也需要离心培养板。
• 用200μL染色工作液将细胞重悬。
  
  • 有时候可添加一定量的非离子表面活性剂如Pluronic F127到Calcein AM内来增强其水溶性。制备染色工作液前，取一管需要用的Calcein AM内加入20% Pluronic F127，使Pluronic F127的终浓度为0.02%。
    
  • 含Pluronic F127的Calcein AM溶液不可长期保存，现配现用。
• 在室温或37℃避光孵育15～20分钟。
  
  • 如果细胞本身含有有机阴离子转运体，需加入丙磺舒（probenecid，1～2.5mM）或者苯磺唑酮（sulfinpyrazone，0.1～0.25mM）到孵育体系内以降低染料Calcein泄露到胞外。
• 用PBS洗涤细胞。
  
  • 如有必要，使用含有阴离子转运抑制剂的缓冲液来进行细胞清洗。
• 用适量PBS重悬细胞。
  
• 用荧光显微镜或流式细胞仪检测结果。最大激发为490nm，最大发射波长为515nm。
  
  • 在荧光显微镜下观察时，如果背景高，可以用培养基再次清洗掉细胞外的染料后再观察。